Le sémaglutide de recherche est livré sous forme de « gâteau » lyophilisé au fond d'un flacon scellé. Avant toute expérience, il faut le remettre en solution, opération que l'on appelle reconstitution. C'est une étape courte, mais elle conditionne l'exactitude de toutes les mesures qui suivront : une erreur de volume se répercute sur chaque prélèvement.
Le matériel à réunir
- le flacon de sémaglutide, sorti du froid et revenu à température ambiante ;
- un solvant stérile : eau bactériostatique (eau contenant 0,9 % d'alcool benzylique) pour un flacon prélevé plusieurs fois, ou eau stérile pour un usage unique ;
- des seringues ou des micropipettes adaptées aux volumes visés ;
- des lingettes à l'alcool pour désinfecter les bouchons ;
- des tubes à microcentrifuger à faible adsorption si vous prévoyez des aliquotes ;
- des étiquettes résistantes au froid et un feutre indélébile ;
- des gants et une surface de travail propre, idéalement sous hotte à flux laminaire.
Pourquoi l'eau bactériostatique ?
L'alcool benzylique freine la prolifération bactérienne quand le bouchon est percé à plusieurs reprises. Pour une solution utilisée sur plusieurs jours, c'est le choix le plus courant. Pour des tests cellulaires sensibles aux conservateurs, on préfère l'eau stérile ou le tampon prévu par le protocole, quitte à préparer immédiatement des aliquotes congelées.
Le protocole pas à pas
- Inspecter le flacon : sceau intact, poudre sèche et compacte, aucune trace d'humidité. Noter le numéro de lot.
- Laisser tempérer le flacon une quinzaine de minutes pour éviter la condensation à l'ouverture.
- Désinfecter le bouchon et celui du solvant à l'alcool, puis laisser sécher.
- Prélever le volume de solvant choisi à l'avance (voir le calculateur plus bas).
- Injecter lentement le solvant contre la paroi interne du flacon, jamais directement sur la poudre, pour éviter la mousse.
- Dissoudre en faisant rouler le flacon entre les doigts ou en le faisant tourner doucement ; ne pas le secouer.
- Contrôler la solution : elle doit être limpide et incolore. Une turbidité ou des particules justifient de ne pas l'utiliser.
- Étiqueter immédiatement : nom, concentration, lot, date de reconstitution, initiales.
Calculer la concentration
La règle est simple : la concentration est égale à la masse du flacon divisée par le volume de solvant ajouté. Un flacon de 10 mg additionné de 2 mL donne 5 mg/mL ; le même flacon avec 4 mL donne 2,5 mg/mL. Le volume à prélever pour une quantité donnée se calcule ensuite en divisant cette quantité par la concentration.
Le choix du volume est un arbitrage. Trop peu de solvant donne une solution très concentrée, où quelques microlitres d'erreur représentent une quantité importante de peptide. Trop de solvant dilue la solution au point que les volumes à prélever deviennent encombrants. Les guides de laboratoire recommandent de viser des prélèvements compris entre 50 et 500 µL, zone où les pipettes sont les plus précises.
Pour des cas plus complexes (unités de seringue, masses en microgrammes, volumes en microlitres), le calculateur de concentration de Peptides EU convertit automatiquement les unités et indique la concentration finale.
Exemples chiffrés
| Flacon | Solvant | Concentration | Volume pour 500 µg |
|---|---|---|---|
| 5 mg | 1 mL | 5 mg/mL | 100 µL |
| 5 mg | 2,5 mL | 2 mg/mL | 250 µL |
| 10 mg | 2 mL | 5 mg/mL | 100 µL |
| 15 mg | 3 mL | 5 mg/mL | 100 µL |
| 20 mg | 4 mL | 5 mg/mL | 100 µL |
| 30 mg | 3 mL | 10 mg/mL | 50 µL |
Les erreurs les plus fréquentes
- Secouer le flacon : l'agitation vigoureuse crée de la mousse et peut dénaturer une partie du peptide.
- Viser la poudre avec le jet de solvant : même effet mécanique, avec en prime des projections sur le bouchon.
- Oublier l'étiquette : une solution sans date ni concentration est inexploitable une semaine plus tard.
- Multiplier les cycles de congélation : mieux vaut fractionner en aliquotes d'emblée que recongeler le flacon entier.
- Confondre mg et µg dans le calcul : un facteur 1 000 qui fausse toute une série d'expériences.
Le distributeur Peptides EU publie un guide de reconstitution des peptides lyophilisés qui reprend ces étapes, utile à imprimer pour la paillasse. La conservation de la solution une fois prête fait l'objet de la page stockage et stabilité.